携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6585-6590.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.005

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携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

曹志强，王阳，刘龙

解放军沈阳军区总医院泌尿男科，辽宁省沈阳市 110840

修回日期:2014-09-18 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 刘龙，硕士，主任医师，解放军沈阳军区总医院泌尿男科，辽宁省沈阳市 110840
作者简介:曹志强，男，1977年生，黑龙江省双城市人，博士，副主任医师，主要从事干细胞应用和肾移植方面的研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金项目(2013020199)

Recombinant CXCR4 gene lentivirus transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Cao Zhi-qiang, Wang Yang, Liu Long

Department of Urinary, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110840, Liaoning Province, China

Revised:2014-09-18 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Liu Long, Master, Chief physician, Department of Urinary, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110840, Liaoning Province, China
About author:Cao Zhi-qiang, M.D., Associate chief physician, Department of Urinary, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110840, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2013020199

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞在体内归巢主要调控因子是CXCR4，如何提高干细胞自身CXCR4的表达量是调节干细胞体内靶器官归巢能力的关键。

目的：构建CXCR4或GFP基因慢病毒表达载体，并观察其对骨髓间充质干细胞自身生长特性及分泌功能的影响。

方法：骨髓间充质干细胞应用慢病毒载体转染系统转染CXCR4基因达到过表达，同时单独转GFP基因作为对照。通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫蛋白印迹方法验证病毒转染效率；流式细胞技术测定骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡情况；Western Blot法测定间充质干细胞培养基上清中分泌蛋白及细胞因子变化。

结果与结论：慢病毒转染系统可以安全、有效地转染CXCR4基因或GFP基因到骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测显示过表达CXCR4的骨髓间充质干细胞增殖能力、生存能力加强，凋亡细胞减少(P < 0.05)；细胞上清蛋白分析提示过表达CXCR4后，骨髓间充质干细胞培养上清内出现很多的蛋白因子升高(P < 0.05)，其中大多数对细胞自身复制及免疫调节有益。结果表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段，可以通过CXCR4基因修饰的方法提高骨髓间充质干细胞的生存能力、降低凋亡率，调节细胞保护性因子及免疫调节因子的分泌功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 慢病毒, 骨髓间充质干细胞, CXCR4, 细胞增殖, 免疫调节因子, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chemokine receptor 4 (CXCR4) is the main homing regulating factor for mesenchymal stem cells in vivo. How to improve the self-expression of CXCR4 is crucial for regulating the homing ability of stem cells in vivo targeting organs.

OBJECTIVE: To construct lentiviral vectors carrying CXCR4 or green fluorescent protein (GFP) gene, and to observe their effects on growth and secrete function of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Lentiviral vectors were used to over-express CXCR4 in rat bone marrow mesenchymal stem cells. GFP gene was transfected as a control. Transfection efficiency was analyzed using fluorescence microscopy, RT-PCR and western blot assay for detecting the expression of CXCR4 or GFP in cells at both the mRNA and protein levels. Effects of CXCR4 expression modified on the cellular proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells were assayed with flow cytometry. Effect of CXCR4 regulation on secretion function of bone marrow mesenchymal stem cells was determined by protein analysis from cell supernatant.

RESULTS AND CONCLUSION: CXCR4 gene or GFP gene could be transfected into bone marrow mesenchymal stem cells safely and effectively with lentivirus transfection system. Analysis of CXCR4 expression at the mRNA and protein levels confirmed the transfection efficiency. Effects of CXCR4 over-expression on the cellular proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and effects of CXCR4 regulation on secretion of protective factors from bone marrow mesenchymal stem cells were improved. The proliferation ability of bone marrow mesenchymal stem cells with CXCR4 over-expression was improved, which was approved with flow cytometry (P < 0.05). And it was helpful for bone marrow mesenchymal stem cells to secrete some protective factors. Many protein and soluble factors were at higher levels, and those were good at cells proliferation and immunoloregulation in bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05). The method of lentiviral transfection is a safe and effective way to modify bone marrow mesenchymal stem cells. We can improve the ability of bone marrow mesenchymal stem cells in the survival and emiocytosis ability through genetic engineering.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, lentivirus, receptors, CXCR4

中图分类号:

R394.2

曹志强，王阳，刘龙. 携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6585-6590.

Cao Zhi-qiang, Wang Yang, Liu Long. Recombinant CXCR4 gene lentivirus transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6585-6590.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年9月在解放军沈阳军区总医院全军重症创伤实验室和心血管内科实验室完成。

材料：

实验动物：2-4周龄SD大鼠6只，体质量100-150 g，购自解放军沈阳军区总医院动物实验中心，所有动物饲养、手术、术后饲养均符合动物伦理原则要求，按照中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》饲养和处理动物^[4]。

慢病毒载体：菌株、293T细胞及慢病毒包装质粒系统：包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G、载体质粒pLenti6.3/V5-DEST(解放军第四军医大学生物化学实验室张健教授惠赠)，CXCR4/GFP表达载体质粒(吉玛公司)。

试剂和仪器：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；Trizol、RIPA裂解液(Sigma公司)；脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠α-tublin单克隆抗体，小鼠抗大鼠白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)、Fas Ligand、血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子受体4(CXCR4)单克隆抗体，二甲基亚砜(Sigma公司)；反转录试剂盒revertaid first strand CDNA synthesis (Thermo sciengtifiki1621)。

实验方法：

幼龄大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养：①以10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉。②体积分数为75%乙醇浸泡15 min消毒。③大鼠固定于无菌操作箱内的手术台上。④剪开皮肤、皮下、肌肉，完全显露股骨和胫骨。⑤保护干骺端，分别取出双侧股骨和胫骨，尽量去除骨外肌肉及脂肪组织，立即放入无血清低糖的DMEM培养基中。⑥眼科剪剪去骨两端软骨和干骺端，显露骨髓腔，注射器抽取含血清的DMEM培养基5 mL反复冲洗骨髓腔，冲洗过程中见粉色浑浊液体流出，待骨髓腔变白后，更换另一骨重复上述步骤冲洗。⑦收集冲洗出来的混合悬液，室温条件下离心，800 r/min，5 min。⑧弃去上清，用10 mL新鲜的含血清DMEM培养基重悬混合物，用移液器转移混合物到一个新的培养瓶中，37 ℃，体积分数为5% CO₂细胞培养孵育。⑨48 h后首次换液，去除悬浮细胞和培养基(主要为悬浮生长细胞和死细胞)，观察贴壁细胞的生长情况。⑩细胞融合80%以上时，开始传代，传至第5代细胞经鉴定后，第6-8代细胞用于下一步转染。

实验分组：转染CXCR4组骨髓间充质干细胞，转染GFP组骨髓间充质干细胞，未转染组骨髓间充质干细胞。

慢病毒包装：在60 mm培养皿内种植1×10⁶的293T细胞，加5 mL培养基(含血清的DMEM)。体积分数为5% CO₂， 37 ℃过夜培养。第2天，1.5 mL无菌离心管内先后加以下试剂：psPAX2质粒(运送质粒PAKGING)、pMD2.G质粒(包装质粒ENCELOPE)、pLenti6.3/目的基因质粒2 μg (CXCR4或GFP)，最后用DMEM调整体积到20 μL。加脂质体转染试剂80 μL，配成100 μL。取100 μL混合物移入6 cm

培养皿中，轻晃混匀，放入体积分数为5% CO₂孵育箱，孵育4 h，更换不含血清的DMEM孵育过夜。第4天后观察有20%-30%的细胞死亡时，小心收集上层培养基，经0.45 μm滤膜滤过掉悬浮的死细胞和细胞碎片后分装，存放于-4 ℃。

建立慢病毒感染细胞稳转系：取融合约50%的骨髓间充质干细胞在60 mm培养皿内种植，CO₂孵箱过夜培养。细胞融合能达到30%-40%，去培养基，加入之前包装慢病毒获得的病毒液1 mL，再加入含血清的DMEM培养基1 mL。每天换用新鲜含稻瘟素(Blasticidin)的培养基，去除含死细胞和杂质的培养基并更换培养基。收集经过筛选获得的具有Blasticidin抗性的骨髓间充质干细胞，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，RT-PCR、Western Blot检测CXCR4、GFP的mRNA和蛋白水平表达情况。

转染后骨髓间充质干细胞增殖及凋亡分析：将细胞以1×10⁶接种于60 mm培养板，80%汇合后转染。48 h后用胰酶消化收集细胞，PBS洗2遍，弃上清，加入1 mL体积分数为70%预冷乙醇中，吹打均匀，4 ℃固定12 h。PBS洗涤去乙醇，1 000 r/min离心5 min，洗2遍。0.5 mL PBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终质量浓度50 mg/L，37 ℃温浴30 min，流式细胞仪测定分析。

细胞上清分泌蛋白检测：直接在细胞培养皿中铺入1×10⁶的骨髓间充质干细胞，培养3 d，细胞达到80%-90%时，收取细胞培养上清液，8 000 r/min低温离心5 min去除沉淀，用Western Blot方法检测细胞培养基上清内的白细胞介素2，白细胞介素10，转化生长因子β，Fas-Ligand，血管内皮生长因子，吲哚胺-2，3-二加氧酶(IDO)水平。

主要观察指标：慢病毒转染间充质干细胞的效率，转染后细胞生长状态、细胞周期与凋亡情况，细胞培养上清蛋白分析。

统计学分析：采用SPSS 13.0进行统计学分析。结果中定量数据用x(_)±s表示，组间差异使用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

成人骨髓中含有多种干细胞，包括造血干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞和纤维细胞。造血干细胞是持续提供人类血细胞的源泉。其他几种细胞，尤其是间充质干细胞，被认为是修复组织损伤和潜在疾病的细胞系^[5]。尽管不同组织的内皮结构不同，但间充质干细胞归巢到不同组织一般都要经过相似的激活、黏附、迁移的过程。间充质干细胞如何完成这一系列复杂过程呢？炎症或损伤部位局部产生的基质细胞衍生因子1(SDF-1)与间充质干细胞表面表达的CXCR4在细胞迁移过程中起到关键作用^[6-7]。但由于骨髓内氧张力较低(1%-7%)，比在常规氧浓度(体积分数21%)环境低很多，体外培养过程中，间充质干细胞表面的CXCR4会逐渐表达下降，而对迁移信号的反应能力会下降^[8]。在体外扩增阶段增加间充质干细胞表面CXCR4的表达至关重要，体外培养阶段对间充质干细胞进行缺氧预适应处理模拟骨髓内氧环境可见增强间充质干细胞的迁移能力^[9-10]。结合药物或生长因子等特定配体后的间充质干细胞黏附能力、迁移能力都可以得到强化^[11-12]。如胰岛素样生长因子1预处理也可以增强间充质干细胞内的CXCR4表达，而且促进其归巢能力，恢复急性肾损伤后的肾脏功能。而阻断CXCR4可以抵消胰岛素样生长因子1的预处理效应^[13-14]。新近研究发现，传统中草药也有促进CXCR4表达，促进间充质干细胞归巢的作用^[15]。此外，电流干预、超声干预、低切应力等干预措施都能够促进间充质干细胞的迁移能力^[16-18]，并都可以被AMD3100阻断，说明CXCR4是间充质干细胞迁移的关键^[19-20]。

基因转染是调节靶基因表达水平的最常用手段。在基于间充质干细胞的基因治疗方案中，使用转染技术时常需要考虑转染效率高低、目的基因表达持续时间、稳定性以及载体自身的免疫原性和安全性等问题。虽然非病毒转染法(如电穿孔和脂质体等方法)简单易行且细胞毒性低，但目前转染效率太低，且对非复制期细胞或一些原代细胞转染困难，包括腺病毒，反转录病毒和慢病毒转染^[21]。这些转染方法虽然转染效率不同，但都可以有效转染CXCR4基因进入间充质干细胞，使其表达成倍增长，归巢效率成倍增长^[22-24]。质粒载体不能整合至宿主细胞的基因组中，不能永久自行复制，同时容易引起宿主细胞的强烈免疫反应；腺病毒载体整合至宿主细胞基因组中，但对间充质干细胞这样的原始细胞感染率低，应用范围很窄；反转录病毒载体因为可以引起宿主细胞基因表达紊乱风险，应用风险大。而且这些病毒载体本身也具有免疫原性^[23^，^25-26]，在治疗许多免疫性相关疾病时问题更加严重。慢病毒载体系统，其拟转染的基因可以整合到基因组中从而长期稳定表达，对间充质干细胞这一类的原始细胞感染率也很高，自身具有很低免疫原性特征，能有效逃避宿主的免疫监视，不会引起宿主的剧烈免疫反应应答，使之在干细胞治疗领域应用越来越多^[27-28]。因此，本研究采用解放军第四军医大学生物化学教研室长期使用的三质粒慢病毒载体系统二代。研究发现，过表达CXCR4的间充质干细胞自身存活、复制能力都得到了加强，有利于体内应用阶段干细胞特性的保持。

而本实验发现调节CXCR4的表达后，间充质干细胞分泌的许多保护性因子也会发生变化，发现过表达CXCR4蛋白的同时，间充质干细胞培养上清很多蛋白、分子发生变化^[29-31]，其中包括白细胞介素2^[32-33]，白细胞介素10^[34-36]，转化生长因子β，Fas Ligand，血管内皮生长因子^[37-38]，吲哚胺-2，3-二加氧酶^[39]，尤其是转化生长因子β和Fas Ligand，已有多项研究和证据显示，这两个细胞因子与调节性T细胞(Treg)的产生密切相关^[40-41]，而Treg是器官移植中免疫耐受的终极靶点^[42]。对间充质干细胞自身及周围免疫微环境的调节都产生积极影响。未来间充质干细胞经修饰后诱发特异性的免疫耐受用于器官移植将是治疗热点。但需指出，慢病毒转染的安全性问题仍有争论，必须注意病毒应用中的不确定性，远期的、大样本的观察有待进行。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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